在表观遗传学研究中，DNA甲基化作为基因表达调控的核心机制之一，其检测技术的精准度直接影响科研与临床诊断的可靠性。当前主流的甲基化转化技术可划分为三大类：基于化学处理的亚硫酸氢盐转化、反向酶法转化EM-seq以及正向酶法转化TAPS。本文将从原理、流程、优缺点及前沿进展等维度，系统解析这三种技术的核心差异与应用场景。

亚硫酸氢盐转化

、经典技术的双刃剑

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技术原理与流程

亚硫酸氢盐转化（Bisulfite Conversion）是DNA甲基化检测的“金标准”，其核心原理是通过亚硫酸氢钠（NaHSO₃）在酸性条件下对DNA进行化学修饰：未甲基化的胞嘧啶（C）被脱氨基转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变。后续通过PCR扩增将U转化为胸腺嘧啶（T），最终通过测序比对C/T比例确定甲基化状态。

典型流程

• 5 min-150 min转化；(翌圣生物推出5 min超快速转化试剂盒，极速转化)；
• 30 min脱硫和洗涤；
• 5 min洗脱核酸。

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技术优势与局限性

优 势

• 高灵敏度：转化效率可达99.5%以上，适用于微量样本（如cfDNA）。
• 成熟度高：自1992年首次应用以来，技术流程已高度标准化。

局限性

• DNA损伤严重：亚硫酸氢盐处理会导致DNA链断裂，片段长度通常缩短至100-1000 bp，会丢失部分基因组信息。
• 碱基失衡：转化后GC含量降低，导致测序数据中AT占比过高，可能掩盖真实甲基化信号。

应用场景

• 肿瘤标志物检测：如肺癌中APC、RASSF1A基因启动子高甲基化。
• 发育生物学研究：追踪胚胎干细胞分化过程中的甲基化重塑。

反向酶法转化EM-seq

温和高效的新选择

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技术原理与流程

EM-seq（Enzymatic Methyl-sequencing）是一种基于酶促反应的甲基化转化技术，其核心流程包括：

DNA甲基化保护

• 使用TET酶保护所有未修饰的C；
• 葡糖基化酶保护5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。

非甲基化C脱氨

• APOBEC脱氨酶将未甲基化的C转化为U；
• 甲基化的C（5mC）和羟甲基化的C（5hmC）被特异性保护。

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技术优势与局限性

优 势

• DNA损伤小：可保留10 kb以上的长片段DNA，适用于全基因组甲基化图谱绘制。
• 兼容性强：可与多种下游分析技术（如甲基化特异性PCR、质谱）结合。

局限性

• 成本较高：酶原料价格昂贵。
• 技术成熟度低：酶的稳定性弱于化学法。

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应用场景

• 全基因组甲基化测序：分析复杂疾病（如神经退行性疾病）的甲基化调控网络。
• 单细胞甲基化研究：结合单细胞测序技术，解析细胞异质性。
• 肿瘤早筛：需要高灵敏度、低损伤的肿瘤早筛或液体活检项目。

正向酶法转化TAPS

精准区分甲基化修饰

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技术原理与流程

TAPS（TET-assisted Pyridine Borane Sequencing）是一种基于氧化酶和化学还原的甲基化转化技术，其核心流程包括：

TET酶氧化

• TET酶将5mC和5hmC氧化为5-羧基胞嘧啶（5caC）；
• 未甲基化的C不受影响。

化学还原

• 吡啶硼烷将5caC还原为二氢尿嘧啶（DHU），后续PCR扩增中DHU转化为T。

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技术优势与局限性

优 势

• 流程简化：酶法氧化+化学还原，减少操作步骤。
• 只转化5mC和5hmC：能保留基因组原来的信息。

• 兼容性强：适配全基因组测序、单细胞甲基化分析等。
• 碱基平衡：酶法转化不改变DNA的GC含量，测序数据质量更高。

局限性

• 转化效率波动：受酶活性影响，批间稳定性需验证。
• 应用场景有限：目前主要用于科研探索，临床转化较少。
• 转化率偏低：转化率≥85%。

应用场景

• 需要高灵敏度、低损伤的肿瘤早筛或液体活检项目。
• 需要一份样本同时检测甲基化和基因突变信息。

技术对比与展望

展 望

1. 多组学整合：将甲基化数据与转录组、蛋白质组数据结合，解析表观遗传调控网络。

2. 自动化与微型化：开发便携式甲基化检测设备，推动床旁诊断（POCT）应用。

探索表观遗传学的奥秘，翌圣生物提供全面的解决方案。我们精心研发的甲基化转化试剂和甲基化建库试剂，确保您在研究DNA甲基化模式时的精确性和可靠性。此外，翌圣的ATAC-seq和CUT-Tag技术，为解析复杂基因调控网络提供了强有力的工具。无论是基础研究还是临床应用，翌圣的表观遗传学原料都是您科研路上的坚实伙伴。

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