![图片3.png 图片3.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKiaADUlyAANWKV5CB9o181.png)
发表期刊:Frontiers in Immunology (IF=7.561)
作者院校:南开大学 & 北京协和医学院
研究方法:RNA 修饰质谱LC-MS、2’-O-甲基化修饰测序(Nm-seq )、mRNA 测序
![图片4.png 图片4.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKiaAfPfFAACPCa7sQIo879.png)
![图片5.png 图片5.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/29/wKj0iWKHLC6ABE6_AA2_SZy794E539.png)
1、病毒感染提升 mRNA 中 Am 修饰的整体水平
研究者首先在 VSV 病毒(Vesicular Stomatitis Virus)感染的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 和未感染的对照组细胞中进行了mRNA 修饰质谱LC-MS,发现核糖 2’-OH 上发生甲基化修饰的腺嘌呤残基(Am)的比例在病毒感染后显著上升。研究者进而对 VSV 病毒感染的小鼠巨噬细胞及未感染病毒的对照组细胞进行了 mRNA 的 2’-O-甲基化修饰测序(Nm-seq ),发现了两组细胞之间存在 6808 个差异 Nm 修饰位点(fold change >=4)。基于组间差异 Nm 修饰位点进行的 GO 分析显示,分子功能(MF)差异主要集中于翻译和 RNA 加工,细胞组分(CC)差异主要集中于外泌体、细胞核以及细胞质,生物功能(BP)差异主要集中于核苷酸结合和蛋白质结合等。基于组间差异 Nm 修饰位点进行的 KEGG pathway 分析显示,差异 Nm 修饰基因主要富集于病毒感染相关的通路当中。Nm 修饰位点在基因内区域的统计显示,大部分 Nm 位点位于编码区(CDS)。研究者还对病毒感染组和对照组的 Nm 修饰 motif 进行了分析,发现 Nm 修饰 motif 在病毒感染前后存在差异,说明病毒感染前后可能造成了不同 RNA 分子的丰度改变。以上证据说明,mRNA 的 Nm 修饰可能参与调节病毒感染以及抗病毒免疫过程。
![图片6.png 图片6.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieAYJA9AAdNeezu6wQ239.png)
2、Nm 甲基化转移酶 FBL 促进病毒感染
研究者对 8 种 Nm 甲基化转移酶(FTSJ1、FTSJ2、FTSJ3、FBL、CMTR1、CMTR2、MRM1、MRM3)进行了 siRNA 敲降实验的筛选,发现敲降 FBL 可以在 RNA 水平、蛋白质水平以及病毒滴度水平抑制 VSV 病毒对小鼠外周血巨噬细胞的感染。研究者通过查询 GEO 数据库发现,系统性红斑狼疮病人的 CD19+ B 细胞和 CD4+ T 细胞相比于健康对照组,FBL 的表达量显著降低,暗示 FBL 可能具有免疫调节的功能。研究者还换用病毒物种以及宿主物种进行了一系列 FBL 敲降后的病毒感染实验,结果均显示 FBL 具有促进病毒感染的功能。
![图片7.png 图片7.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieARJfIAAXYAPlWgss564.png)
3、FBL 在感染早期促进 VSV 病毒进入巨噬细胞
Ⅰ 型干扰素(IFN-I) 和干扰素刺激基因(Interferon Stimulated Genes, ISGs)在抗病毒先天免疫中扮演重要的角色。然而,当发生 VSV 病毒感染时,在 FBL 敲降的小鼠外周血巨噬细胞中,相比于对照组的细胞,IFN- α、IFN- β 以及 IFN-I 信号通路中的其它分子却并没有显著变化。研究者还发现,FBL 敲降也不影响小鼠外周血巨噬细胞的活性。不过,在 VSV 感染后 0h、4h、7h、10h 针对病毒感染相关蛋白分子的 Western Blot 实验中发现,FBL 敲降可在病毒感染早期抑制 VSV 蛋白的表达。研究者因此进一步进行了 VSV 结合细胞以及进入细胞的检测,发现 FBL 敲降并不影响 VSV 与细胞的结合,但会抑制 VSV 进入细胞。
研究者在基因编辑 FBL 敲除杂合子细胞系(Fbl+/-)和对照组细胞(Fbl+/+)做了mRNA 测序(3 vs 3),发现 FBL 敲除细胞中的多个干扰素刺激基因(Interferon Stimulated Genes, ISGs)的表达发生了上调。这种上调现象无需病毒感染作为刺激条件。针对 Ifi44、Oas2、Ifit3、Ddx60、Oasl1、Bst2、Ifit1 等几个 ISGs 的 RT-qPCR 也发现,这些基因的 mRNA 在 FBL 敲降的细胞中表达水平发生上调。
因此,作者认为,FBL 在正常生理条件下扮演了免疫抑制剂的角色。当 FBL 被敲降时,一些抗病毒的免疫基因的表达增加,因此抑制 VSV 病毒进入巨噬细胞。
![图片9.png 图片9.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieARSQKAATCgdpQuv0079.png)
5 、敲降 FBL 可通过 IFN-I 信号通路提升 ISGs 表达,从而抑制病毒进入细胞
早先的研究显示,IFN-I 可以通过 IFNAR-JAK-STAT 信号通路来诱导 ISGs 的表达。研究者发现,在 IFNAR 沉默的细胞系中,如果再敲降 FBL 的话,将无法提升 ISGs 的表达,也不能抑制 VSV 病毒进入细胞。并且,当人为引入充足的 IFN-β 刺激条件时,即使 FBL 敲降也不能提升 ISGs 的表达水平。综上所述我们可以得出结论:FBL 是通过 IFN-I 信号通路来起到提升 ISGs 表达水平的作用的。
![图片10.png 图片10.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieARCaaAAEc5U6bWpY431.png)
6 、FBL 介导的 RNA 2’-O-甲基化修饰抑制先天免疫系统的激活以及 IFN-I 的表达
研究者在基因编辑 FBL 敲除杂合子细胞系(Fbl+/-)和对照组细胞(Fbl+/+)中进行了 mRNA 修饰质谱LC-MS,发现 FBL 敲除细胞系中的 Am 修饰比例显著下降。FBL 细胞中类似的 Nm 修饰比例下降现象也出现在总 RNA 的修饰质谱检测(5 vs 5)结果当中,且可以被 FBl 过表达载体所逆转。以上证据说明,FBL 催化了 Nm 修饰的发生。
据报道,mRNA 的 5’ 帽子结构上的 Nm 修饰可以用于区分内源 RNA 和外源 RNA:在灵长类细胞和小鼠细胞实验中,缺乏 5’ 帽子结构 Nm 修饰的外源病毒 mRNA 可被细胞识别并弱化(attenuate)。因此,作者推测,在 FBL 敲降的巨噬细胞中,低 Nm 修饰的内源 RNA 可能被误识别为外源 RNA,从而激活先天免疫系统 IFN-I 相关信号的表达。一系列 mRNA 和蛋白质定量检测实验结果都显示,FBL 敲降的巨噬细胞中 IFN-β 以及抗病毒免疫信号通路的一些分子都发生了上调,印证了作者的猜想。
![图片11.png 图片11.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieASsPiAAPAQBLp5lQ541.png)
7、FBL 通过 MDA5 介导对 IFN-I 信号和 ISGs 的调控
MDA5 和 RIG-I 都是常见的病毒 RNA 识别分子。研究者分别构建了 MDA5 和 RIG-I 敲除细胞系,并在此基础上进行 FBL 敲降实验,检测 ISGs 的 mRNA 表达水平以及 VSV 进入细胞后的 mRNA 表达水平。实验结果发现,在 MDA5 敲除细胞系中,FBL 敲降处理将不会影响 ISGs 的表达,也不会影响 VSV 进入细胞,说明 FBL 作用于 MDA5 的上游。
![图片12.png 图片12.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieAMWeXAASmtFjB-2w204.png)
综上所述,作者发现 Nm 甲基化转移酶 FBL 可催化包括 mRNA 在内的小鼠巨噬细胞 RNA 发生 Nm 修饰。这种 Nm 修饰水平可被 MDA5 识别检测,如果 FBL 表达受抑制、 Nm 修饰水平降低,则会被 MDA5 解读为外源 RNA 的信号,激活 IFN-I 相关信号,进而促进 ISGs 的表达,引发抗病毒的先天免疫反应。由于病毒感染可以抑制 FBL 的表达,因此最终可以反过来阻止更多病毒进入细胞。
![图片13.png 图片13.png](https://img01.71360.com/file/read/www/M00/D2/27/wKj0iWKHKieALnC2AAJE42G1Tl8639.png)
单碱基分辨
可对2’-O-甲基化修饰进行单碱基定位。
高通量检测
可对全转录组范围内的2’-O-甲基化修饰位点进行高通量地平行检测。
全分子覆盖
可全面地对mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA等多类RNA分子的2’-O-甲基化修饰位点进行检测。
一站式服务
客户仅需提供组织或细胞,云序生物一站式完成RNA抽提,样品预处理,建库,测序,数据分析全套流程。
专业的生物信息学分析
专业的生物信息学团队,能够满足客户的各类深入数据分析需求。
01 RNA修饰测序
云序生物可提供针对m6A、m5C、m1A、m7G、m6Am、ac4C、O8G、Nm 等多种不同的 RNA 修饰类型,对 mRNA、lncRNA、pri-miRNA、tRNA和rRNA 等多种类型的 RNA 进行修饰测序。
02 检测整体 RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 RNA修饰上游酶的筛选
RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控RNA修饰的 Writer/Eraser/Reader 蛋白。
04 RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。
5.3双荧光素酶实验
验证两基因互作,研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。
往期回顾
上海云序生物科技有限公司 商家主页
地 址: 上海市松江区莘砖公路518号24号楼4楼
联系人: 戴小姐
电 话: 021-64878766
传 真: 021-64878766
Email:market@cloud-seq.com.cn;liuqingqing@cloud-seq.com.cn
相关咨询
杨宝峰院士团队RNA修饰又一成果 | 云序ac4C acRIP-seq助力揭示心脏I/R损伤的作用机制 (2024-12-03T00:00 浏览数:5754)
杨宝峰院士团队最新成果 | 云序助力揭示RNA修饰m7G调控心肌肥厚的机制研究 (2024-11-13T00:00 浏览数:7455)
Nature子刊| 重磅综述!一文总结「m6A修饰非编码RNAs」在各类肿瘤中的调控机制及作用 (暂无发布时间 浏览数:6991)
研究速览-eccDNA 2023年最新进展大放送! (暂无发布时间 浏览数:6540)
云序生物MeRIP-qPCR技术干货 (暂无发布时间 浏览数:6824)
技术干货| “eccDNA碱基序列的获取及引物设计”方法教程 (暂无发布时间 浏览数:6808)
云序客户m6A高分文章|揭示组蛋白乙酰化与m6A修饰在眼部黑色素瘤发生中的共同作用机制 (暂无发布时间 浏览数:4114)
Nat Biotechnol IF=47 | BID-seq:一种基于单碱基分辨率的假尿嘧啶(Ψ)修饰定量测序检测方法 (暂无发布时间 浏览数:3772)
北大伊成器团队Nature Reviews重磅发文:非m6A热门修饰调控与功能一文速览! (暂无发布时间 浏览数:5878)
用户文章m6A专题|IF=9.8|m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏会加重钴致神经退行性损伤 (暂无发布时间 浏览数:3909)